Identification of SNPs Associated with Tobacco Brown-Spot Resistance Based on Re-sequencing

Wang Wenjing ¹　Wang Fenglong ¹　Jiao Fangchan ²　Sun Guangjun ³　Song Guanglong ³　Chen Fenglei ³　Wang Weimin ⁴　Wu Jingjing ⁴　Wang Xiaoqiang ¹*

1 Tobacco Research Institute, CAAS, Qingdao 266101; 2 Yunnan Academy of Tobacco Agriculture Sciences, Kunmin, 655021; 3 Guizhou Tobacco company, Guiyang, 550004; 4 Zhengjiang Zhongyan Industry Co. Ltd, Hangzhou, 310000

*Corresponding author, wangxiaoqiang@caas.cn

Abstract Brown-spot is an important leaf disease to tobacco, which causes huge yield loss on tobacco production annually. Development of brown-spot resistant cultivars is a great measure to reduce the yield reduction caused by this pathogen. Thus, identification and utilization of brown-spot resistance genes is of great value to tobacco resistance breeding. To identify brown-spot resistance molecular markers, we developed an F2 population with tobacco cultivars Beinhart 1000-1, an important brown-spot resistant cultivar, and K326, a brown-spot susceptible cultivar with good industrial processing qualities, in this study. And, 19 resistant lines and 19 susceptible lines were obtained by brown-spot resistance screening and were subjected to genomic re-sequencing. Then, marker-trait association analyses was carried out based on the phenotypic characteristics and the genomic re-sequencing data to identify SNPs associated with tobacco brown-spot resistance. These assays identified ~1.7 million differential SNPs and 10 genes associated with tobacco brown-spot resistance. Findings of this study are helpful for tobacco resistance breeding against brown-spot.

Keywords　Tobacco brown spot; Re-sequencing; SNPs

赤星病是烟草(Nicotiana tabacum L.)生产上最具破坏性的叶部病害之一，广泛分布在世界各大烟区。该病主要在烟草生长后期发生，在条件适宜的年份经常大流行，给烟草产业造成巨大损失。目前对烟草赤星病的防治主要包括：种植抗病品种、使用化学药剂和采取合理栽培措施等手段，但是，从环境安全、农业生产及经济效益等方面考虑，培育烟草抗赤星病品种是最根本的解决方法。

在作物育种方面，分子育种技术可以克服育种周期长、偶然性大和效率低下等缺点，是一种高效的育种方法。然而，有关烟草赤星病抗性的形成机制多集中在传统遗传学领域，研究不够深入，抗病基因的鉴定还比较欠缺，限制了烟草的赤星病抗性分子育种进程。因此，对烟草赤星病抗性关联遗传位点进行发掘、鉴定和利用，开展烟草赤星病抗性分子育种，是解决烟草赤星病抗性的重要技术路径。随着分子生物学技术的发展，从基因组水平上对育种亲本进行系统的分析发掘与利用亲本中的抗性基因已成为一种重要研究方法，特别是近年来测序技术的飞速发展，已发展出多种高通量的分子标记鉴定技术，可以对亲本的抗性标记位点进行快速、全面的分析，推动分子育种工作进度。重测序是对基因组序列已知物种的不同个体进行基因组测序，分析个体或群体基因序列差异性，揭示基因组水平分子突变和变异的高通量测序方法，目前已成为挖掘作物育种亲本分子标记的重要手段，并在水稻(Oryza sativa L.) (Qiu et al., 2017)、大豆[Glycine max (Linn.) Merr.] (Torkamaneh et al., 2018)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) (张国儒等, 2019)、马铃薯(Lycopersicon esculentum Mill.) (尹明华等, 2020)、油菜(Brassica napus L.) (胡鸣等, 2018)等作物上得到了应用。

雪茄烟Beinhart 10001-1是一个重要的抗赤星病烟草种质资源，在烟草赤星病抗病育种中具有重要应用价值，但对其抗赤星病的分子机制研究有限，赤星病抗性相关基因尚不明确(高亭亭等, 2014)。为挖掘烟草的赤星病抗性关联位点，本研究选用加工品质好但易感赤星病的烟草品种K326与Beinhart1000-1进行杂交构建了F2代杂交分离群体，并对F2代杂交分离群体进行了赤星病抗、感材料的鉴定，将筛选出的赤星病抗、感材料单株及对照材料进行基因组重测序分析，挖掘鉴定样本赤星病抗性关联SNP位点，鉴定抗病候选基因，为抗赤星病烟草品种的培育奠定基础。

1结果与分析

1.1分离群体的构建及抗感性材料鉴定筛选

对500株F2代杂交分离单株的叶片赤星病接种试验表明F2代植株对赤星病产生了抗性分离，约有19株高抗赤星病烟草，186株抗性较高，190株抗性较低，及20株易感赤星病单株，另有一些难于判别的材料未作统计。随后，选取19株高抗植株和19株易感植株，提取了叶片材料基因组DNA，将DNA样品送往天津诺禾致源生物公司进行重测序。提取的样品DNA电泳结果(部分)如图1所示。

图1 提取的重测序样品DNA电泳 Figure 1 Electrophoresis of DNA samples

1.2基因组重测序及测序数据质量评估

本次测序共产生233.952 G的raw data (初级测序数据)，及232.83 G的clean data (处理后测序数据)，各样本的raw data 在40.693 ~96.656 G之间，测序质量评估值为Q20≥97.03%、Q30≥93.31%，GC含量在39.51%~39.63%之间(表1)。因此，本次测序所获数据GC分布正常，测序数据量足，可用于进一步的数据分析。

表1 重测序数据质量评估数据表 Table1 Statistics of quality evalution of sequencing data

1.3与参考基因组比对情况

目前公开的栽培烟草基因组数据主要有白肋烟TN90和烤烟K326的基因组数据，相关信息可在Sol Genomics Network (https://solgenomics.net/)网站查阅。本研究以K326的基因组数据作为参考基因组，参考基因组大小为3 752 655 195 bp (表2)，分析结果显示重测序样本的数据与参考基因组的数据比对率在98.53%~99.23%之间(表3)。比对结果正常，可用于后续的变异位点检测及赤星病抗性关联位点分析。

表2 参考基因组基本情况 Table 2 Basic statistics of reference genome

表3 重测序深度及基因组覆盖度统计 Table 3 Statistics of sequencing depth and coverage

1.4 SNP位点检测及注释

通过赤星病抗、感两个群体的重测序数据与参考基因组数据的比对，2个样本共检测到1 695 975个SNP位点，其中转换型SNP位点有1 141 360个，颠换型SNP位点有554 615个，转换型SNP位点数量与颠换型SNP位点数量的比率为2.057。结果分析发现，SNP位点的变异主要集中在基因间区，其比例约占总数的95.51%；其次是内含子区域，其比例约占总数的2.25%；发生在基因上下游1 kb区域内的变异位点共有8 800多个，其比例约占总数的0.52%；发生在外显子区域的同义与非同义SNP变异位点约占总数的1.22% (表4)。基因间区及内含子区域的变异大多与基因表达和转录水平的剪切调控有关，大量变异位点发生在这两个区域初步表明用于建库重测序的Beinhart1000-1和K326之间的差异与转录水平的调控高度相关。

表4 SNP统计注释 Table 4 SNP statistical annotation results

1.5烟草赤星病抗性关联基因筛选

基因差异是生物特性的决定因子，然而，有关赤星病抗性的研究主要还集中在传统遗传学研究，明确的赤星病抗性决定基因还未得到克隆鉴定。本研究在比较分析Beinhart1000-1和K326的赤星病抗、感分离群体的SNP位点差异基础上，鉴定了10个赤星病抗性关联基因，这些基因涉及到生物体内的多个重要生物过程，包括：蛋白泛素化降解系统、能量代谢、钾转运、精氨酸合成等与生物体重要生理过程相关的基因(表5)。

表5 赤星病抗性关联基因注释 Table 5 Annotation of brown spot resistance associated genes

2讨论

雪茄烟品种Beinhart1000-1是重要的抗赤星病资源，多年来各国科学家对其进行了大量研究工作。第一张烟草SSR遗传图谱于2007年公布(Bindler et al., 2007)，相比于其他主要农作物，烟草QTL定位研究起步较晚。高亭亭等(2014)的研究结果表明Beinhart1000-1的赤星病抗性由显性基因控制，共获得2个抗赤星病QTL位点，分别位于7号和15号连锁群上。童治军等(2019)利用Beinhart1000-1和感病烤烟品种红花大金元创建的F2单株群体构建了一张包含670个SSR标记的烟草遗传连锁图谱，通过全基因组检测获得2个与烟草赤星病抗性相关的QTL，分别位于第20和23连锁群上，且这2个QTL等位基因均来自抗病亲本Beinhart1000-1。净叶黄是另一个我国烟草育种上应用的主要赤星病抗源，近几年对其遗传规律也进行了相关研究。蒋彩虹等(2012)的研究结果表明净叶黄对赤星病的抗性由单基因和微效多基因调控，并定位到一个与抗性基因相关的SSR分子标记。冯莹等(2015)的研究结果表明净叶黄和Beinhart1000-1的赤星病抗性均受两对加性-完全显性主基因+加性-显性多基因控制，表明赤星病的抗性遗传以主基因效应为主，并且受环境影响较大。以上研究主要集中在传统遗传学研究领域，对抗性基因的QTL分布进行了研究，但并没有鉴定到具体的抗性相关基因。

本研究采用高通量重测序方法对由19个抗赤星病烟草和19个感赤星病烟草构成的群体材料进行SNP差异位点分析，并对烟草的赤星病抗性关联基因进行了鉴定。测序结果显示不同抗性的烟草群体之间存在着全基因组水平的丰富变异，各样本的差异SNP位点数目约170万。在分析烟草赤星病抗、感群体的SNP差异位点基础上，本研究共鉴定出10个赤星病抗性关联基因，其中包括精氨酸琥珀酸合成酶，这与精氨酸可以调节植物抗病性的研究结果相一致，精氨酸及其代谢产物能够调节植物的抗病性，外源精胺可通过活性氧(ROS)激活植物防卫基因和超敏反应(hypersensitive response, HR)，实现系统获得抗性(杨洪强和高华君, 2007)；筛选到的抗性基因还包括E3泛素连接酶MARCH8类似物，前人研究证实泛素蛋白酶系统参与植物胁迫感应并激活其下游反应，与植物抗病性密切相关(胡婷丽等, 2014)。此外，本研究筛选到的钾转运因子6类似物、肌醇需求酶1、能量代谢相关基因ADP-核糖基化因子等是生物体内重要生理过程的组成蛋白。综上所述，本研究筛选到的基因涉及的信号通路有泛素化、能量代谢、叶绿体、微量元素运输等重要生物过程，表明烟草体内重要信号通路参与了对赤星病的抗性调控，对揭示烟草抗赤星病机理有重要意义，为烟草抗赤星病分子育种提供一定基础。

3材料与方法

3.1试验材料

本实验以烟草抗性品种Beinhart 1000-1和K326为试验材料，这两个品种均为烟草所植保中心自己保存。试验中所用的烟草赤星病病原菌在烟草研究所植物保护中心实验室自己保存。

3.2分离群体抗感性材料的鉴定筛选

通过人工杂交的方式创建烟草赤星病抗性材料Beinhart1000-1与易感材料K326的F1代材料，并通过F1代材料的自交培育了Beinhart1000-1和K326的F2代分离群体500株。利用人工接种鉴定的方法对获得的F2代杂交群体材料进行赤星病抗、感材料的鉴定，分别选取有代表性的抗性材料和敏感材料，用于后面的重测序分析。

3.3 DNA提取与质量检测

从500株烟草F2代中筛选出19株高抗赤星病植株和19株感病植株作为试验样品。使用CTAB法提取样品叶片材料基因组DNA，将DNA合格样品送往天津诺禾致源生物公司进行重测序。

3.4文库构建与测序

文库的构建采用TruSeq Library Construction Kit进行。将质量检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350 bp的片段，然后严格按照TruSeq Library Construction Kit说明书的步骤完成整个文库的制备。构建好的文库通过illumina HiSeqTM PE150进行测序。

3.5 SNP检测及注释结果统计

将有效测序数据通过BWA软件(参数: mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组。再通过ANNOVAR软件工具对检测出的基因变异进行功能注释，寻找所测样本与参考基因组之间存在的差异性基因。

作者贡献

王文静是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王凤龙，焦芳婵及孙光军完成数据分析，论文初稿的写作；宋光龙，陈风雷，王卫民和吴晶晶参与实验设计，试验结果分析以及参与论文修改；王晓强是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

基金项目

本研究由中国农业科学院创新团队经费(ASTIP-TRIC04)、中国烟草总公司云南省公司项目“优质抗病烤烟新品种选育”(2019530000241001)、中国烟草总公司贵州省公司项目“贵州烟草叶斑类病害成灾规律与绿色防控技术示范”(201920)共同资助。

参考文献

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